聊聊细胞转染那些事

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转染是采用除病毒感染外的其他方法将核酸(DNA或RNA)人工导入细胞的过程。采用各种化学、生物学或物理方法导入外源性核酸会改变细胞的特性,从而实现细胞基因功能和蛋白质表达研究。

转染的主要目的是:①生产重组蛋白;②特异性地提升或抑制转染细胞中的基因表达。因此,转染即可用于基因或基因产物的功能和调控研究,又可用于生产转基因生物并用作基因治疗方法。

转染最常通过质粒载体或mRNA在细胞培养中表达目的蛋白。

转染可以分为瞬时转染和稳定转染

瞬时转染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,导入的核酸只在细胞中存在一段时间,未整合至基因组。因此,在细胞分裂过程中,瞬时转染的遗传物质不会传递至下一代,其会在环境因素影响下丢失或在细胞分裂过程中被冲淡。但一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,会产生高水平的表达,但通常只持续几天。根据使用的重组体不同,瞬时表达的转基因可以在1至7天内检出,但瞬时转染的细胞一般在转染24至96小时收获。基因产物分析需提取RNA或蛋白质进行酶活性分析或免疫分析。
稳定转染:外源DNA/RNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在,即外源DNA被整合至细胞基因组中,或者作为附着体质粒存在。稳定转染可以使外源性DNA长期存在于转染细胞及其子代细胞中。因此,稳定转染可以使导入基因在多代细胞中永久性地表达,适用于重组蛋白生产和外源性DNA表达的下游或长期效应分析。通常只有单个或几个拷贝的外源性DNA被整合至稳定转染细胞的基因组中且其概率相率较低。
瞬时和稳定转染的区别:

转染分类方法:

不同转染方法的原理,应用及特点:

影响转染实验的因素:

1.细胞类型:各细胞类型对特定转染试剂或方法的反应各异。
2.细胞健康与活性:①至少有90%的细胞为活细胞②复苏后传代次数低于30次的细胞③尽量复苏新的细胞进行转染,且复苏后传代3或4次。
3.汇合:不要使细胞维持在汇合状态超过24小时。采用阳离子脂质介导的转染在转染时,贴壁细胞达70-90%汇合,悬浮细胞达5×10^6~2×10^6  cells/ml。
4.培养基:使用新鲜的培养基。
5.血清:一般而言,培养基中加入血清可以提高DNA转染效率。但是,在进行阳离子脂质体介导转染时,必须在没有血清存在的情况下形成DNA-脂质体复合物,因为一些血清蛋白会干扰复合物的形成。
6.抗生素:①瞬时转染时可以使用含抗生物的培养基,但不推荐转染时培养基中加入抗生物;②稳定转染时,选择培养基中不得使用青霉素和链霉素。
7.转染分子的类型:①质粒DNA是最常用的转染载体。但质粒DNA的线性或超螺旋结构和大小会影响转染效率;②超螺旋DNA进行瞬时转染可以获得最高的效率;③稳定转染,细胞对线性DNA的摄取水平低于超螺旋DNA,但它可以将DNA最佳整合至基因组
8.转染方法

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