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导读：自从新冠肺炎疫情出现后，mRNA就广泛进入大众的视野。目前，鉴于肽表位的多样性和I类主要组织相容性复合物（MHCI）的多态性，将mRNA同时递送到多个抗原（Ag）特异性CD8⁺T细胞群仍可视为一项挑战。

由于免疫反应的复杂性，向不同群体的Ag特异性T细胞的多重递送仍然具有挑战性。故Science期刊发表的一篇文章《In vivo mRNA delivery to virus-specific T cells by light-induced ligand exchange of MHC class I antigen-presenting nanoparticles》研究了如何通过光诱导MHC I类抗原呈递纳米颗粒的配体交换来向病毒特异性T细胞递送mRNA，即使用pMHCI分子，该分子用可光裂解的肽重折叠，以允许通过UV光进行快速配体交换。

本文分为4个部分：

Part 1概述使用pMHCI形成T细胞背景；

Part 2使用pMHCI递送T细胞研究方法；

Part 3讲述APNs如何与Ag特异性T细胞结合，并诱导mRNA转染内化；

Part 4得出结论——使用APN可有效将多重mRNA递送至病毒特异性T细胞，可潜在扩展以转染更广泛的Ag特异性T细胞亚群。

我们知道，抗原（Ag）特异性CD8⁺T细胞表达T细胞受体（TCR），该受体识别与细胞表面表达的主要组织相容性复合物I类（MHCI）分子结合的加工肽Ag。TCR-肽-MHCI（pMHCI）相互作用形成了CD8⁺T细胞识别的精确特异性及其对携带同源pMHCI Ags的靶细胞的细胞毒活性的基础。最近的研究包括免疫调节分子（如转化生长因子-抑制剂）的传递，使用纳米粒子修饰T细胞表面标记的抗体，包括CD3和细胞程序性死亡蛋白-1（PD-1），以增强肿瘤微环境中的效应功能。

用载有核酸的聚合物/脂质纳米粒（LNPs）编程内源性CD3⁺或CD8⁺T细胞，如CD45小干扰RNA（siRNA）和嵌合Ag受体（CAR）编码的DNA可显示出沉默T细胞靶基因或原位制造CAR T细胞的潜力。靶向Ag特异性T细胞的能力提供了在体内选择性增强疾病相关T细胞亚群的机会，同时维持免疫系统的稳态和自身耐受性。

为了在体内靶向Ag特异性T细胞，策略包括工程化人pMHCI [人白细胞Ag（HLA）]-Fc融合二聚体以扩增人乳头瘤病毒（HPV）特异性CD8⁺T细胞以抵抗HPV相关恶性肿瘤或通过免疫正电子发射断层扫描成像追踪病毒特异性CD8⁺T细胞，由纳米颗粒上的pMHCI或工程红细胞组成的人工Ag呈递细胞以激活Ag特异性T细胞并增强其对癌症治疗的效应功能，肿瘤靶向抗体以递送被肿瘤蛋白酶切割的病毒肽，然后加载到肿瘤细胞表面的MHCI上，以将病毒特异性T细胞重定向至肿瘤，和用pMHCII分子修饰的纳米颗粒将自身抗原反应性CD4⁺T细胞重编程为抑制疾病的调节性T细胞（Treg）。

传统上，pMHCI分子通过单独的重折叠反应表达，以将三个组分（不变轻链、多态重链和肽配体）组装到内源性pMHCI的异三聚体结构中。利用紫外光介导的肽交换，用含有光不稳定基团的牺牲肽重折叠重链和轻链，从而在紫外光光切割时，牺牲肽解离以允许交换肽结合到MHCI呈现凹槽。对于特定的MHC等位基因，一批对UV敏感的pMHCI分子可以按常规进行重折叠，然后在实验中产生数百个携带不同肽的pMHC分子。

笔者团队开发了使用紫外光介导的配体交换合成的Ag呈递纳米颗粒（APNs），以将mRNA递送到多个流感特异性CD8⁺T细胞。与抗体（如CD3和CD8）相比，文章使用的方法提高了T细胞递送的精确度，可快速扩展到不同的肽表位，并且通过mRNA递送，将实现从T细胞治疗的原位制造到基因组编辑和调节的一系列应用。使用紫外光介导的配体交换从牺牲的pMHCI前体中产生一组pMHCI分子，该前体被脂尾位点特异性修饰。这允许肽交换后插入预先形成的LNPs，该LNPs封装了编码重链（VHH）抗体上骆驼单可变结构域的模型mRNA报告子。然后笔者团队发现，用常规重折叠或肽交换的pMHCI分子修饰的APN在体内的多个TCR转基因小鼠模型（P14、Pmel-1和OT-1）中可靶向和转染Ag特异性CD8⁺T细胞，而不考虑MHC同种型（P14和Pmel的H2-Db和OT-1的H2-Kb）。在重组甲型流感病毒感染（用GP33Ag修饰的a/PuertoRico/8/34H1N1，缩写为PR8-GP33）的小鼠模型中，静脉内给药肽交换APN（NP366/Db、PA224/Db和GP33/Db）的三重混合物导致了前三个免疫显性PR8-GP33特异性T细胞群的同时转染，与脾脏和肝脏中的其他主要细胞群相比，这一转染效率显著更高。文章数据表明，紫外光介导的肽交换允许APNs的平行产生，用于在体内向多个Ag特异性CD8⁺T细胞群递送功能性mRNA。

笔者团队采用的方法是用脂质修饰的衍生物插入预制纳米颗粒，用疏水相互作用稳定的配体修饰纳米颗粒。笔者团队首先试图表达重组pMHCI分子，该分子具有用于脂质缀合的位点特异性处理，使得复合物可以作为插入LNPs前肽交换的起点（图1A）。然后用重链中的C端半胱氨酸表达并重折叠了淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）Ag GP33/Db（KAVYNFATM/Db），以防止天然二硫键断裂，并保持TCR识别的正确pMHCI取向。然后将它们与1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）-PEG2000马来酰亚胺反应，生成脂质修饰的GP33/Db分子。

图1 MHCI APNs的UV介导肽交换用于体内多重递送至病毒特异性T细胞的示意图

同时通过微流体混合器合成了封装增强型绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA的基于MC3的LNP，其特征在于动态光散射的平均直径为93.85 nm，ζ电位为−30.20±0.5 mV（图2，A和B）。脂质修饰的GP33/Db pMHCI分子插入后不会显著增加LNP大小，也不会改变zeta电位（分别为107.9±7.34 nm和−22.73±4.7 mV）（图2，B和C）。使用双辛可宁酸（BCA）蛋白质定量证实了各种APN制剂的成功插入后（表1）。笔者团队还使用RiboGreen试验评估了eGFP mRNA浓度，并发现裸LNP和APN相当（分别为80.20±0.50%至73.62±0.58%）（图1C）。

图2 抗原呈递纳米颗粒（APNs）的合成和表征

表1 使用BCA分析试剂盒定量APN上的pMHC

随即，笔者团队测试了GP33/Db APNs是否可以选择性地与从TCR转基因P14小鼠分离的同源CD8+T细胞结合，该小鼠的CD8+T表达特异性识别LCMV GP33/Db-Ag的TCR（图3A）。然后发现GP33/Db APNs与约97%的P14 CD8+T细胞结合，而非昆虫GP100/Db（KVPRNQDWL/Db）APNs显示出最小的染色（3.22%）（图3B）。然后进一步使用H2 Kb限制性OVA/Kb（SIINFEKL/Kb）APN测试APN结合，并观察到与非编码NS2/Kb（RTFSFSQLI/Kb）的APN相比，当与从OT-1转基因小鼠分离的同源CD8+T细胞共培养时，类似的Ag特异性结合（图3C）。发现NS2/Kb APN对OT-1 CD8+脾细胞的10%交叉反应性可能是由于H2-Kb MHC对CD8+T细胞上CD8共受体的结合亲和力。

仅有此不足以完全证明假设，于是笔者团队接下来研究了APN与T细胞的结合是否会诱导T细胞内化，因为已知pMHCI多聚体在生理温度下通过TCR聚集和受体介导的内吞作用被T细胞快速吸收。发现在4°C下孵育的细胞的DiD荧光降低，表明APN在酸洗前保留在细胞表面（图3，D和E）。但在在37°C下处理的细胞，荧光没有变化，表明APN的有效T细胞内化。

相比之下，笔者团队发现在所有条件下，OT-1 CD8⁺T细胞均未结合和内化非昆虫GP100/Db APNs（图3E）。为了确定pMHCI诱导的TCR内化是否会导致向T细胞传递功能性mRNA，文章使用了负载eGFP mRNA的GP33/Db APN孵育P14脾细胞。与用磷酸盐缓冲盐水（PBS；MFI，153）或游离mRNA（MFI，118）处理的脾细胞相比，观察到APN转染的CD8+T细胞的eGFP表达呈剂量依赖性[平均荧光强度（MFI）分别为397和506，分别为1和2μg mRNA剂量]（图3F）。实验结果表明，同源APNs靶向、结合和诱导T细胞摄取，以在体外传递功能性mRNA。

图3 APNs靶向Ag特异性T细胞并诱导体外细胞摄取

在有上述实验做基础后，笔者团队接下来量化了TCR转基因P14小鼠中GP33/Db APN的体内生物分布和转染效率（图4A）。文章使用了负载有萤火虫荧光素酶（Fluc）mRNA的APN测试了向主要器官的功能递送（图4，B和C）。发现与非昆虫GP100/Db APN相比，从用GP33/Db APNs处理的小鼠分离的脾脏中的发光显著更高。值得注意的是，两组之间的其他主要器官没有观察到显著差异。为了量化向T细胞的递送，笔者团队在输注封装VHH mRNA的DiD标记的APN 24小时后收获P14脾细胞，并观察到同源GP33/Db APN靶向P14 CD8+T细胞的>95%，而GP100/Db APP对照导致<2%的结合，如DiD荧光所量化的（图4D）。为了量化功能性递送，笔者团队使用编码糖基磷脂酰肌醇（GPI）膜锚定VHH的mRNA作为报告基因，因已证明其可实现持久的表面表达（>28天），可以通过抗VHH抗体的免疫荧光染色来检测。然后对VHH的表面表达进行染色，并发现GP33/Db APNs与其非致癌物对应物相比，导致显著更高的转染效率（图4，E和F）。值得注意的是，在用GP33/Db APN或GP100/Db APNs处理的小鼠中观察到CD8-脾细胞的转染（<2%）可忽略不计。结合通过IVIS成像在器官水平观察到的结果（图4，B和C），数据表明，在脾脏中观察到的Fluc发光主要来自同源CD8⁺脾细胞的转染。文章中使用Pmel小鼠在不同的模型中进一步证实了此结果，该小鼠已被工程化以表达针对GP100/Db的同源TCR。

图4 APNs靶向并转染TCR转基因P14小鼠中的Ag特异性T细胞

与之前在P14小鼠中的结果类似，观察到用GP100/Db APNs处理的Pmel CD8+脾细胞体内转染约30 %至40 %，而用GP33/Db非致癌APNs转染约3 %（图5）。总之，这些结果表明APNs能够以Ag特异性方式实现T细胞靶向和功能性mRNA递送。

图5 从Pmel TCR分离的CD8+脾细胞中APN介导的体内转染转基因小鼠

Ag特异性CD8⁺T细胞是获得性免疫的关键参与者，其直接杀死表达限制于MHCI呈递的同源肽Ags的靶细胞的能力，正用于细胞疗法、疫苗和自身免疫中。文章开发了用于使用UV介导的肽交换将多重mRNA递送至Ag特异性T细胞的APN，以加速针对一组肽表位的APN的产生。

APN适用于其他pMHCI分子，包括由人CD8⁺T细胞表达的HLA。且APN在转染多种病毒特异性T细胞群中的能力可用于诱导病毒特异性T细胞的体内增殖以治疗病毒介导的癌症。除CD8⁺T细胞外，通过用pMHCII产生APN，有可能将APN的转染能力扩展到CD4⁺T细胞。通过文章数据可知，使用APN可有效将多重mRNA递送至病毒特异性T细胞，可潜在扩展以转染更广泛的Ag特异性T细胞亚群。

[1] FANG-YI-SU, QINGYANG HENRY ZHAO,etc, In vivo mRNA delivery to virus-specific T cells by light-in-duced ligand exchange of MHC class l antigen-present-ing nanoparticles，2022.02.23.

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